Universidad de León, 24071 León
INTRODUCCIÓN
Los distintos tipos de polimorfismos de DNA se han mostrado como los marcadores más útiles para el control de parentesco y la identificación individual, tanto en seres humanos (Alford et al., 1994), como en animales domésticos (Pepin et al., 1995). Entre ellos, los empleados con mayor frecuencia, son los microsatélites o secuencias STR (Simple Tandem Repeats), debido a que pueden ser analizados mediante PCR y por lo tanto, la prueba de parentesco se realiza de una manera fácil, rápida y con unas necesidades mínimas de material biológico. La gran variedad de microsatélites descritos en las distintas especies de animales domésticos, permite diseñar reacciones de amplificación para varios marcadores ("multiplex"), de modo que con una sola manipulación laboratorial se analizan varios loci independientes de forma simultánea y se alcanza un alto poder de resolución de genealogías dudosas (Heyen et al., 1997).
Además, se ha observado una elevada conservación de este tipo de marcadores STR entre especies filogenéticamente cercanas, especialmente entre las distintas especies de rumiantes (Forbes et al., 1995; Pepin et al., 1995), de forma que un mismo marcador puede ser amplificado en individuos de especies distintas.
El propósito del presente trabajo es diseñar un sistema de control genealógico, basado en técnicas "multiplex", que pueda utilizarse en las tres especies de rumiantes domésticos (vaca, oveja y cabra) indistintamente y que alcance un poder de exclusión a priori superior al 99,9%.
MATERIAL Y MÉTODOS
El DNA se ha obtenido a partir de muestras de sangre o semen, utilizando el procedimiento de Miller et al. (1988).
Los marcadores utilizados y su localización cromosómica, así como las condiciones de PCR en cada reacción "multiplex" se detallan en la tabla 1.
Los productos de la reacción de PCR se mezclaron en las proporciones siguientes: 1 (Fam); 1,3 (Hex), 2 (Tet) y 5,7 de H2O, respectivamente. Previamente a la migración electroforética se añadió 1 µl de la mezcla anterior, 0,5 µl del estándar de tamaño (GENESCAN-350â ), 4 µl formamida y 0,5 µl de tampón de carga (25 mM EDTA, 50 mg/ml azul dextrano). La mezcla final se desnaturalizó durante 4 minutos a 94ºC y se hizo migrar sobre un gel de secuenciación (4,25% poliacrilamida, 7M de urea), durante 2 horas, en un secuenciador automático ABI377. Los productos se analizaron con los programas de Applied-Biosystem: GeneScan para el análisis de tamaños y Genotyper 2.1 para la asignación de los alelos.
Los parámetros de variabilidad se han estimado a partir 32 muestras de
ganado vacuno y otras tantas de ganado ovino, en ambos casos procedentes de 4 razas
diferentes; además de 52 muestras de ganado caprino pertenecientes a un solo rebaño de
raza Saanen. El cálculo del poder de exclusión en un problema de parentesco se realizó
utilizando las expresiones PE para individuos elegidos al azar en la
población y PSn para individuos emparentados, propuestas por Jamieson
(1994). Para el contenido en información del polimorfismo (PIC) se ha empleado la
fórmula de Botstein et al. (1980). El cómputo de exclusión conjunta PC
para varios polimorfismos se ha calculado utilizando la expresión:
Donde PEi es la probabilidad de exclusión de cada marcador y n el número total de marcadores.
Tabla 1. Marcadores utilizados, localización cromosómica, condiciones de PCR y composición de las reacciones "multiplex"